Методы диагностики и идентификации бактерий – возбудителей болезней рыб

Исследования бактериальных болезней рыб показали, что с каждым годом количество выделяемых условно патогенных микроорганизмов становится все больше и больше. Заболевания, вызываемые каким-то одним возбудителем, сейчас практически не встречаются. Даже такие заболевания, как фурункулез, вибриоз, миксобактериоз, аэромоноз осложняются присутствием условно патогенных микроорганизмов. Все это очень осложняет диагностику, установление причины заболевания, а самое главное – выбор средства лечения, так как у многочисленных членов микробиоценоза чувствительность к антибактериальным препаратам может весьма различаться, и подавляя рост одних представителей, мы создаем условия для более бурного развития других.
Для получения достоверных результатов исследования посев от рыбы с клиническими признаками проводится непосредственно на плотные питательные среды. При массовых обследованиях посев производят из печени и почек стерильно вскрытой рыбы на мясо-пептонный агар (МПА) или эритритагар и среду Эндо, при подозрении на миксобактериоз – на среду Анакера-Ордала или Сабуро, на которых миксобактерии вырастают в виде голубоватых расплывчатых колоний или с желтым центром («глазунья»). На МПА или эритритагаре отмечают уровень обсемененности, а по морфологическим признакам можно отметить предположительно наличие флавобактерий (по окраске колоний от желтого до оранжевого цвета), неферментирующих щелочеобразователей (НФЩ) – ацинетобактеров и моракселл (уплощенные колонии белого цвета), эпидермального стафилококка (выпуклые колонии белого цвета) или золотистого (колонии ярко-желтого цвета). На среде Эндо отмечают энтеробактерии различных родов: бактерии группы кишечной палочки – (БГКП) с различной интенсивностью окраски, в виде бледно-розовых колоний могут быть цитробактер, клебсиелла, энтеробактер, протей, аэромонады, НФЩ и БГКП с ослабленной ферментативной активностью. На среде Сабуро могут расти, кроме миксобактерий, дрожжеподобные и плесневые грибы. Если анамнестические данные неясные, производят дополнительный посев на энтерококкагар, на котором учитывают рост энтерококка.
После просмотра чашек отобранные колонии (прежде всего те, которые в большинстве) пересевают на первично-дифференцирующую среду Клиглера, по характеру роста на которой по результатам микроскопирования после проведения теста на каталазу, цитохромоксидазу, проводят предварительную идентификацию выросшей культуры до рода, а после посева на среду Хью-Лейфсона (проверка О/Ф теста) уточняют родовую принадлежность выделенной культуры.
Определение каталазной и цитохромоксидазной активности проводят по общепринятой методике, а для проведения О/Ф тестирования разливают среду Хью-Лейфсона в пробирки по 9–10 мл и культуру засевают уколом до дна. Таким образом, используется одна пробирка, а не две и не нужно вазелиновое масло, что облегчает процесс мытья посуды. При таком методе посева ферментация начинается снизу, а окисление сверху. На этой же среде определяется и подвижность культуры: неподвижная культура растет строго по уколу, слабо подвижная – в виде корня с отростками, подвижная – вызывает помутнение всей среды.
Идентифицированные энтеробактерии и аэромонады засевают на среду с ДНК для определения их вирулентности. Эти же и остальные отобранные культуры засевают на чашки с МПА или эритритагаром для изучения антибиограмм методом индикаторных дисков. Таким же способом можно проверять вирулентность и у энтеробактерий. После анализа всех полученных данных выдают заключение.
На практике приходится наблюдать феномен «роения» (ползучий рост, присущий ранее только протею) у бактерий группы кишечной палочки (БГКП), аэромонад, моракселл, ацинетобактеров. При этом одна колония может расползтись по всей поверхности среды. Кроме этого, многие бактерии вырабатывают капсулу, которая служит защитой от воздействия неблагоприятных факторов окружающей среды, и размеры этой капсулы иногда такие, что тяжи с поверхности колоний стекают на крышку чашки Петри. Прежде всего это Pseudomonas fluorescens var. capsulata, а также могут быть аэромонады, БГКП, НФЩ и некоторые энтеробактерии. У выделенных аэромонад в обязательном порядке необходимо проверять вирулентность.
Давно известно, что аэромонады являются важной составляющей водного микробиоценоза и принимают активное участие в процессах самоочищения водоема. Однако в условиях усиления агрессивности среды, когда возникает опасность гибели бактериальной клетки, она активизирует свои защитные свойства, ферментные системы, в результате чего повышается и вирулентность. Это свойство проверяется на ДНК-агаре. Определение у штаммов аэромонад, выделенных из рыбы и выделенных из воды, ДНК активности позволило установить по степени вирулентности их эпизоотическую значимость. Видовую принадлежность выделенных культур определяют путем посева на «пестрый» ряд Гисса.

Материал подготовлен специалистами Лаборатории по диагностике АЧС
и других особо опасных заболеваний животных
ФГБУ «Ростовский референтный центр Россельхознадзора».